番石榴促花芽分化的方法 创新培养基促进番石榴幼苗微繁殖的研究与应用

文 |黛月白

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番石榴（Psidium guajava）是一种源自热带美洲的多年生植物，在全球范围内迅速传播，得益于其高产性和适应性。它主要分布在美洲、亚洲和澳大利亚地区，近期开始在欧洲地中海地区出现。

在希腊，番石榴被广泛种植，特别是在南部、东爱琴海群岛以及克里特岛等凉爽的亚热带地区。据报道，希腊的番石榴作物并没有严重的害虫和病害问题。尽管在田间发现了来自埃及的根结线虫Meloidogyne enterolobi，这是番石榴的一种著名病原体，它给作物造成了重要的损失，并且在地中海地区被视为检疫线虫。

番石榴被广泛用于民间药物，并在许多国家用于治疗各种传染性和非传染性疾病。人们使用其果实、叶子和树皮来治疗各种疾病，许多拉美、加勒比、印度、非洲和印度尼西亚的国家，使用番石榴制成的产品，治疗各种传染性和非传染性疾病。众多植物化学物质的抗氧化、抗炎、抗菌、免疫调节、抗高血糖和抗高血脂作用所致。

番石榴富含维生素C，其含量是橙子的4倍。此外，番石榴还具备观赏价值，拥有美丽白色、大型且微香的花朵，以及芳香且常绿的叶子。

番石榴适应性强，可以在海拔从海平面到2100米的各种气候和土壤条件下良好生长。最适宜的生长条件包括温度在20至30摄氏度之间，年降雨量在1000至2000毫米之间，并且土壤要有较好的排水性，pH值在5至7之间。

与其他物种类似，番石榴用于嫁接的砧木苗的面临各种挑战，传统的番石榴繁殖方法受限，因为像其他木本植物一样，番石榴有一个漫长的幼年生长期和自交不亲和性，种子繁殖会导致在同一果园或分开的果园中生长的遗传异质个体。

在商业果园中，番石榴的有性繁殖对于增加果树的强度、产量和果实质量至关重要。无性繁殖是一种常用的繁殖方法，番石榴可以通过根茎法、穿接法、压水法、扦插法、嫁接法和吻合法成功进行繁殖。

其中，根茎法在层压法和压水法中对番石榴的成活率和生长参数有明显影响。与传统工具相比，使用组织培养砧木进行番石榴繁殖具有几个优点。

首先，在受控条件下能够快速进行克隆繁殖，节省时间和资源。其次，可以利用更少的初始植物材料实现高效繁殖。此外，通过组织培养能够获得更好、更健康的植株生长和发育状况。克隆繁殖还有助于减少植株间的变异，确保克隆体种群的均匀性和独特性。

虽然番石榴的体外培养存在着一些问题，例如培养基中苯酚类化合物的褐变和微生物污染，但是通过发展组培技术来将有助于番石榴产业的未来发展。

在希腊，这些植物材料的母株被种植在田间，并在每年的11月施肥，必要时使用水溶性肥料。这些植株每年的11月结出果实并成熟。

在进行番石榴种子的培养时，首先将从成熟果实中取出的种子，并使用70%乙醇进行表面消毒，持续3至4分钟，然后使用15%次氯酸钠溶液进行消毒。每100毫升溶液中加入160微升Tween® 20，并将其放置在旋转摇床上过夜，随后用无菌蒸馏水洗涤三次。

所有种子转移到含有10毫升MS 培养基的150×200毫米试管中，培养基中含有25克/升蔗糖并加入6克/升琼脂以实现凝胶化，培养基不含激素，在添加凝胶剂和在121°C下进行20分钟的高压灭菌前，使用1摩尔/升盐酸或1摩尔/升氢氧化钾将pH调整为5.8，在冷白色荧光灯下，维持在25±1°C和16小时的光周期条件下进行培养。

发芽种子的茎系外植体转移到封闭的Magenta® B盖婴儿食品瓶中，尺寸为62.4mm×95.8mm，容量为200ml，含有30ml相同的培养基，开始形成茎状体的外植体经解剖分离成单个茎状体，每4周重复一次此过程，直至获得足够的植物材料用于进一步的实验。

第一个实验中，使用了以下培养基，MS基础培养基，WP基础培养基和新的培养基，单独或与修改后的维生素溶液一起，即MS vit ，MS full，WP vit ，WP full， full，第一个实验基于MS、WP培养基结合维生素代替维生素溶液。

不含激素，加入25 g L−1蔗糖，在6 g L−1琼脂糖中固化，调节pH值，并像之前一样进行高压灭菌，主要使用茎尖和在某些情况下使用茎间作为外植体，实验采用完全随机设计，包括五个处理，每个处理有四个重复，每个重复平均使用四个外植体。

外植体在四周后转移到新的培养基中，实验开始后8周进行结果评估，测量内容包括每个外植体和处理的茎和根的数量、茎和根的长度，在接下来的实验中，用2-3周龄的离体形成的茎尖作为初始外植体。

在进行第二个实验时，外植体转移到婴儿食品瓶中，每个瓶内含有35 mL加入BA的培养基，茎状体增殖实验采用完全随机设计，包括五个处理，每个处理有四个重复，每个重复平均使用四个外植体。

在第三个实验中，外植体转移到婴儿食品瓶中，每个瓶内含有35 mL加入0.1 mg L−1 NAA和0、0.5、1、2或4 mg L−1 BA的培养基，茎状体增殖实验采用完全随机设计，包括五个处理，每个处理有四个重复，每个重复平均使用四个外植体，在实验开始后8周测量每个外植体和处理的茎和根的数量、茎和根的长度。

对于第四次实验，外植体被转移到装有35 mL加入0.5 mg L−1 NAA和0、0.1、0.5、1.0、1.5 mg L−1 IAA或IBA的培养基的婴儿食品瓶中，根的增殖实验采用完全随机设计，包括九个处理，每个处理有四个重复，每个重复平均使用四个外植体。

在第五个实验中，离体发根植物被转移到，装有无激素的培养基的婴儿食品瓶中，该培养基中加入了3g L−1琼脂，培养条件为25±1°C和16小时的日照，使用冷白色荧光灯照明，在这样的条件下维持2个星期，然后转移到温室环境中进一步适应环境。

在容器中适应离体发根微型植物时，用自来水小心地冲洗以去除附着的培养基，然后将其转移到填充有土壤基质混合物的30 cm x 50 cm塑料苗床托盘中，土壤基质混合物由泥炭苔、蛭石和珍珠岩组成。

然后将苗床托盘放入一个可调湿度袋中，第一周相对湿度从75%到82%，第二周降至55%到62%，2个星期后，P. guajava植物的托盘被转移到温室的一个架子上继续2个星期，在此期间通过洒水进行灌溉，将植物移植到装有泥炭苔、蛭石和土壤的1升盆中，然后将其移动到室外苗圃，在那里完成植物的适应。2个月后记录成功适应的植物数量和百分比。

从离体发芽的种子中获得了九个番石榴基因型，使用NucleoSpin® Plant II试剂盒按照厂家说明从年轻的番石榴叶片中提取和分离DNA，使用Eppendorf BioPhotometer在260 nm波长下进行标准分光光度测量来定量提取到的DNA，并通过1%琼脂糖凝胶电泳评估其完整性，然后将样品稀释至20 ng μL−1工作浓度。

ISSR分析按照之前的描述进行，但有一些修改，简要地说，使用六个互补于简单序列重复的寡核苷酸引物，进行聚合酶链式反应扩增，扩增反应体系总体积为25 μL，含以下试剂，0.5 μL dNTPs，2.5 μL 10倍缓冲液，1 μL 引物，0.5 μL 模板DNA，0.2 μL Taq聚合酶和20.3 μL 灭菌去离子水。

二进制数据点表示在相同引物的两组重复扩增中，所有样品中每个可辨别带的存在/缺失情况，PCR扩增在Eppendorf Mastercycler EP热循环仪中进行，步骤如下，首先在95°C下进行5分钟的DNA变性。

然后进行35个周期，DNA变性时在95°C下持续30秒，引物退火时在48–56°C下持续90秒，链延伸时在72°C下持续90秒，完成35个周期后，保持温度在72°C下5分钟，扩增产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，并用Midori绿色直接染色，使用1-kb DNA梯度作为大小标记，凝胶图像由FastGene FAS-DIGI PRO记录下来。

根据SCoT分析的步骤，使用了五个互补于密码子目标多态性的寡核苷酸引物进行PCR扩增，扩增反应体系总体积为25 μL，含以下试剂，0.5 μL dNTPs，2.5 μL 10倍缓冲液，1 μL 引物，1 μL 模板DNA，0.2 μL Taq聚合酶和19.3 μL 灭菌去离子水。

二进制数据点表示在相同引物的两组重复扩增中，所有样品中每个可辨别带的存在/缺失情况，PCR扩增在Eppendorf Mastercycler EP热循环仪中进行，步骤如下，首先在95°C下进行5分钟的DNA变性。

然后进行35个周期，DNA变性时在95°C下持续30秒，引物退火时在50°C下持续90秒，链延伸时在72°C下持续90秒，完成35个周期后，保持温度在72°C下5分钟，扩增产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，并用Midori绿色直接染色，使用1-kb DNA梯度作为大小标记。凝胶图像由FastGene FAS-DIGI PRO记录下来。

对Psidium guajava发芽和生根的两个实验数据，进行了完全随机设计的分析，实验只进行了一次，使用Duncan的多重比较程序在显著性水平α=0.05下进行了均值分离，所有的统计分析都使用SPSS® v.20.0统计软件进行。

等位基因的存在得分为'1'，缺失得分为'0'。只对清晰、可重复的带进行手动得分，ISSR的片段大小范围从500到3100碱基，SCoT为650到4000碱基，所有分析均使用GenAlex 6.5，和Microsoft® Excel 2010/XLSTAT©-Pro软件进行。

在基因型之间确定了Nei的遗传距离，并使用UNJ聚类方法对基因型进行分组，根据所进行的方法计算了Nei的系数，以评估种群内的遗传变异，数据进行处理，生成观察到的等位基因数，有效等位基因数，Shanon信息指数，多样性，无偏多样性和多态性位点百分比，还使用GenAlex软件进行了主坐标分析分析。

对于P. guajava种子来说，最合适的NaOCl浓度为15%，可以达到97.3%的消毒率，经消毒处理的来自单个果实的种子，被置于不含任何生长调节剂的基础培养基MS中，以确保无菌状态，直到发芽，经过3个月，96%的种子发芽，发芽种子的芽部外植体被重新培养，直到产生足够的植物材料，供进一步的实验和开始下一个芽部增殖实验。

使用的八种不同浓度对于生根来说与对照组相比，在根数方面没有显著差异，但是在根长方面在最后一种处理与其后三种处理之间存在显著差异，在这个阶段，外植体仍然继续生长，因此计算了每个外植体的茎长。

最后一种处理中的茎长比1.0 IAA和0.5 IBA组显著长，生根的微型植株具有良好的整体外观，准备在温室条件下进行培养外离体适应。

从婴儿食品罐中获得，并移植到土壤基质中的144个微型植株，在尼龙隧道内经过前两个星期后，成功率达到89.5％，在温室的培养台上达到93％，在主幼苗园区的第三阶段，对于在户外强化植物的所有被移植到1升盆中的植物，其存活率达到100％，在适应完成后，总的初步植物材料的存活率降至83.3％。

实验的下一步是对所检测种群的等位基因图案进行GenAlEx分析，ISSR的结果显示，不同等位基因的平均数为1.889，有效等位基因数为1.587，Shanon信息指数为0.498，无偏期望杂合度为0.379。

在SCoT分析中，不同等位基因的平均数为1.961，有效等位基因数为1.651，Shanon信息指数为0.547，无偏期望杂合度为0.418，ISSR的多态性位点百分比为88.89%，而SCoT为96.10%。

根据ISSR的PCoA分析，样本被分为两组，大多数样本集中在图的左侧，而样本Gu8和Gu9则在图的右侧形成另一组，根据SCoT的PCoA分析，样本分散在整个图上，每个象限形成1个组，第一组中，样本Gu6和Gu7位于图的左上部分，样本Gu1和Gu8位于图的左下部分，Gu2和Gu4位于图的右上部分，Gu3、Gu5和Gu9位于图的右下部分。

这是首次在希腊研究红芭乐，该作物在希腊南部亚热带地区适应性良好，展示了一种适用于红芭乐苗木微繁殖的新培养基，该培养基在后续的繁殖和育种计划中有进一步应用的潜力，并可在该物种的应用生物技术中找到应用，ISSR和SCoT标记可以准确描述产生的种质资源的遗传距离，因此在未来的育种研究中可以有效应用这些标记。

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