猫病毒检测有必要吗？这些病毒多重PCR检测方法建立及病原学分析

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随着人们物质水平的提高，宠物正越来越多地出现在人们的生活中。

宠物猫相对宠物狗的饲养，其自我适应能力强，不易给饲养者造成太大负担，不需要过多的时间陪伴和管理，更适合现代城市年轻人饲养，饲养数量和占比逐年上升。

在浦东地区越来越多的人成为养猫一族，但宠物猫常因为烈性传染病而丧失生命，根据本课题组对浦东几家大型宠物诊所诊疗结果分析，猫细小病毒、猫冠状病毒以及猫疱疹病毒等感染日趋严重，成为危害宠物业重大疫病之一，给我区宠物养殖带来了巨大危害，同时也威胁着公共卫生安全和人类的健康。

猫瘟热，也称为猫泛白细胞减少症、猫传染性肠炎，是猫细小病毒(Feline panleukopenia virus)感染导致的猫及猫科动物的一种急性热性接触性传染病，此病传染性极强，死亡率高，并且发病的大多是幼猫，这是一种具有发热性、高度接触性以及致死性的病毒性疾病。

猫传染性鼻气管炎，又称猫传支，是由猫疱疹病毒1型(FHV-1）引起的猫的一种急性、高度接触性上呼吸道疾病。

FHV-1感染幼猫后主要诱发流涎、咳嗽、鼻眼脓性分泌物等上呼吸道症状以及结膜炎、角膜树枝状溃疡、眼周皮肤溃疡等眼部临床症状，发病率为100 %，病死率可达50 %，患病猫康复后可持续带毒，造成持续性感染或潜伏感染。

猫冠状病毒病包括猫传染性腹膜炎（FIP）和猫肠道冠状病毒感染（FECV），是由猫冠状病毒（FCV）引起的疾病。

其症状包括嗜睡、发热、厌食、体重减轻、黄疸、淋巴结增大、呕吐、腹泻、发育迟缓以及出现胸腔、腹腔以及心包积液的现象，绝大多数最终死亡。

本次试验首先建立并验证多重PCR检测方法，针对浦东地区4家宠物医院2020-2021年，门诊初步诊断为上述3个疾病的病例，采集发病猫的咽拭子、口腔拭子、鼻拭子、粪便等，送上海交通大学抗体工程实验室检测，并完成了检出病原的测序和进化树分析。

猫细小病毒、猫疱疹病毒和冠状病毒多重PCR检测方法建立

以猫细小病毒（FPV）、猫疱疹病毒（FHV-1）和猫冠状病毒(FCV)为检测目标， 通过分析其基因序列， 筛选到理想的基因检测靶点，依此设计引物，特别要针对FPV,FHV-1,FCV设计不同的引物，建立同时检测以上三种病原体的多重PCR检测方法，并通过实际样品检测，优化参数，达到能直接从临床样品同时检测多种病原体的多重PCR检测方法。

样品来源

样品为2020～2021年度上海浦东区多家宠物医院采集的疑似上述病毒猫病例的鼻腔、咽喉棉拭子和粪便样本，于-40℃保存。

实验材料

病毒基因DNA/RNA提取试剂盒（购自上海少辛生物有限公司）、RNA反转录试剂盒（购自宝日医生生物技术有限公司）、梯度PCR仪（美国ABI）、核酸蛋白电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

实验方法

 样品总DNA/RNA提取及RNA反转录

按试剂盒说明书步骤进行样品总DNA/RNA提取及反转录。

单个病毒PCR检测方法的建立

 引物设计

根据文献报道选择扩增病毒保守基因序列的引物，由上海铂尚生物公司合成引物。

引物序列及PCR产物

 PCR扩增

根据文献报道的退火温度，分别设置三种病毒的PCR扩增程序。

扩增结束后由1.5 %琼脂糖凝胶电泳鉴定产物（120V,30 min），紫外凝胶成像系统观察结果。

电泳条带单一且大小正确的PCR产物送至上海铂尚生物公司进行测序。

多重PCR方法的建立

根据单个PCR试验结果，选定不同退火温度和时间进行多重PCR试验，扩增结束后由1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物（120 V,30 min），紫外凝胶成像系统观察结果，选定试验参数。

多重PCR方法灵敏度检测

将提取的3种病毒的DNA或由RNA反转录得到的cDNA，稀释调整质量浓度为1 ng/μL，以10倍稀释法进行梯度稀释，用不同稀释倍数的模板进行PCR检测，测定多重PCR方法的最低检测限。

多重PCR方法的特异性鉴定

采用已建立的三重PCR方法，对3种病毒混合阳性样品、单一阳性样品以及流感病毒、犬腺病毒、 犬副流感病毒阳性样品分别进行扩增，扩增产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

多重PCR方法的临床验证

将-40 ℃保存的12份疑似感染上述病毒猫病例的样本提取总DNA/RNA，立即进行反转录。

用本研究建立的三重PCR方法进行检测。

猫细小病毒、猫疱疹病毒和猫冠状病毒的序列分析

将使用本文建立的三重PCR方法扩增阳性的病毒条带回收，选取数份病毒扩增片段送至上海铂尚生物公司进行测序。

之后于NCBI网站上下载数株参考株序列与之进行序列比对分析。

实验结果

单个病毒PCR检测结果

FPV扩增反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环；最终72 ℃延伸5 min。

FHV1及FCV扩增反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环；最终72 ℃延伸5 min。

三对引物扩增产物的电泳条带单一且大小正确，三对引物扩增产物的序列比对结果显示与目的病毒基因相符。

引物FPV扩增条带（301bp)

引物FHV-1扩增条带（531bp)

引物FCV扩增条带（156bp)

引物FPV扩增条带序列比对结果

引物FHV-1扩增条带序列比对结果

引物FCV扩增条带序列比对结果

多重PCR参数确定

根据试验结果，确定多重PCR体系：2×Taq Mix 12.5μL，三对上、下游引物各1μL，混合模板3μL,ddH2O 3.5Ml。

扩增反应条件为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,54 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环；最终72 ℃延伸5 min。

多重PCR方法的灵敏度

梯度稀释模板的PCR检测结果显示，样品FCV 最低检测质量浓度为1×10-3 ng/μL,FHV1和 FPC最低检测质量浓度均为1×10 -4 ng/μL，与单个PCR灵敏度检测结果一致。

梯度稀释模板的PCR检测结果

1:1ng/μL;2:1×10-1 ng/μL;3:1×10-3 ng/μL;4:1×10-4 ng/μL;5:1×10-5 ng/μL;6:1×10-6 ng/μL;7:1×10-7 ng/μL

多重PCR方法的特异性

对已建立的三重PCR方法进行特异性检测，从图8可以看出：FPV、FHV-1和FCV的单一和混合样品均获目的条带，而流感病毒、犬腺病毒、犬副流感病毒样品均未出现特异性条带。

三重PCR特异性检测结果

1:FCV;2:FPV;3:FHV1;4:FCV、FPV和FHV-1三种病毒阳性样品提取混合物；5：流感病毒；6：犬腺病毒；7：犬副流感病毒；8：阴性对照

多重PCR方法的临床验证

使用本文建立的三重PCR方法扩增66份病例样品，检测到33份FPV阳性（阳性率50 %），1份FHV-1阳性（阳性率1.5 %），10份FCV阳性（阳性率15 %）,部分检测结果见图9-11。

多重PCR检测结果与单个病毒的PCR检测结果一致。

样品1-10多重PCR检测结果

样品14-26多重PCR检测结果

样品40-56多重PCR检测结果

66份样品，根据临床症状，采集发病猫的咽拭子、口腔拭子、鼻拭子、粪便等，共检出猫细小病毒（FPV)33份、猫冠状病毒（FCV))10份、猫疱疹病毒（FHV-1)1份。

检出最多的猫细小病毒的样品病原检出率达到50 %。

猫细小病毒、猫疱疹病毒和猫冠状病毒的序列分析

利用 MEGA 6 软件构建系统进化发育树，猫细小病毒、猫疱疹病毒和猫冠状病毒系统进化发育树的结果。

结果显示 ，上海浦东收集到的猫细小病毒主要分为两大分支，只有一例52号病例身上携带的猫细小病毒其基因序列与NCBI网站上下载数株参考株序列位于同一分支,遗传距离较近；上海浦东收集到的唯一一例猫疱疹病毒则是与2018年在土耳其收集到的Tur/Kays58株遗传距离最近；上海浦东收集到的猫冠状病毒同样呈现出明显的序列相似性，同源性最近的参考株则是2018年在泰国收集到的THA-KU03株。

猫细小病毒系统进化发育树

猫疱疹病毒系统进化发育树

猫冠状病毒系统进化发育树

浦东地区是上海宠物养殖量增加最快的地区之一，随着猫养殖数量的增加，临床发病也在趋向多样化和混合感染，给临床诊断和防治造成了困难。

根据近年来对浦东地区一些宠物诊所的临床观测及数据积累和统计分析，猫细小病毒、猫疱疹病毒和冠状病毒等混合感染现日渐突出，发病率逐年上升。

一些诊所就诊率可达30 %以上，有的甚至高达45 %左右，严重困扰着当地宠物业的健康发展，也给人的健康造成隐患。

通过长期系统的调查研究后认为，造成这些病高发的原因是多方面的，其中以诊断滞后和准确性差为主要原因。

因此研究建立一套包括分子生物学、临床症状分析以及病理学观测的包括猫细小病毒病、疱疹病毒和冠状病毒病等重要病毒病在内的诊断技术规程，使其尽快在浦东新区诊所进行推广，规范诊断标准，提高诊断的准确性，及时进行科学的诊治，是今后一段时间内浦东地区养猫业面临的紧迫课题之一。

对传染病的诊断和普通内科病要求不一样，其发病机制及危害的特殊性决定了传染病的诊断必须有病原学检测作保障。

目前诊所通用方法是血清学快速检测诊断盒，无法区分康复和感染状态，而常规的诊断病毒病方法则需要电镜检查检测病毒的感染状态。

近年来虽然也有一些关于猫细小病毒、疱疹病毒、猫冠状病毒PCR检测方法的报道，但大都是针对一个病原的单重PCR，有关同时检测多个病原的多重PCR报道较少，这无法满足临床上应对多种病临床症状相似，且多种病毒经常混合感染的现状而进行准确快速诊断的需求。

鉴于浦东新区近年来宠物猫细小病毒、猫疱疹病毒和冠状病毒等重要病毒感染门诊量急增,且多种病毒往往是混合感染、难以区别这一状况, 本项目研究建立的猫细小病毒、猫疱疹病毒和冠状病毒多重PCR检测方法，对浦东地区部分诊所收集的猫细小病毒、猫疱疹病毒和冠状病毒单独或混合感染样品进行检测，结果显示具有较好的灵敏度和特异性。

将诊断技术规程在基层进行推广和基层技术人员培训，可为浦东地区宠物疫病防治提供可靠的技术支撑。