猫肾b超影像结构分析：通过原发性肾淀粉样蛋白沉积

文丨七号记编辑丨七号记

淀粉样变性是一组发生在人类和动物身上的疾病，其特征是聚集的蛋白质在器官中异常沉积，也被称之为淀粉样蛋白，主要存在于各种器官和组织的细胞外空间，影响它们的结构和功能。

在阿比西尼亚猫品种中，研究人员发现了一种家族性肾淀粉样变性病。根据相关的调查研究，他们应用并整合了多组学分析，来探索猫未知发病过程的某些方面。

在人类中，已经鉴定出多种不同的细胞外原纤维蛋白类型，它们与不同的疾病类型有关。而在动物中，系统性淀粉样变性很少见，主要特征是沉积物中蛋白质 AA 占优势。根据研究人员调查，病例继发于家养动物的慢性炎症、传染性疾病或肿瘤性疾病。

家猫在年轻时会发展淀粉样变性，而且通常没有预先存在炎症状况的相关证据。该疾病在猫类两个品种中被描述为原发性和家族性：阿比西尼亚猫，主要是肾脏形式和肝脏形式 ,阿比西尼亚肾淀粉样变性的三个一致报告的特征是相关猫的发生，AA 蛋白的全身沉积，在肾脏中的存在显著增加，以及肾功能衰竭导致的早期死亡。

研究中使用的样本“Sample_ID”：Fcat是全基因组序列feline 99 Lives initiative，PN是米兰大学兽医系的protocol number。“状态”是与淀粉样变性相关的健康状态。“死亡年龄”报告为年、月。“性别”：M = 男性，F = 女性，NF = 绝育女性。“类型”是从中提取的样本 DNA。“分析”是对样本进行的组学分析。“受淀粉样蛋白影响的组织”是尸检时具有淀粉样蛋白沉积物的组织。

六只猫的福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 肾脏标本，三只患有淀粉样变性（一只雄性、一只雌性、一只绝育雌性；分别为 A1、A2、A3）和三只健康猫（未受淀粉样变性影响：一只雌性，两只绝育）雌性；分别为（A5、A4、A6），可在米兰大学兽医系获得，并分别进行蛋白质组学和 miRNA 组学分析。

WGS 数据如前所述，作为猫科动物99生命计划的一部分。全基因组测序、序列处理、变体检出和 NCBI 的详细信息先前已有报道。WGS 数据与 V9.0 Felis catus参考程序集对齐。 来自 99 Lives 项目的另外 195 只不同品种的猫和随机繁殖的猫的 WGS 用于基因组变异检测。

对照种群包括另外两名阿比西尼亚人，一个是参考基因组，另一个因不同的性状参加了99生命计划。所有 WGS 数据都可以通过 99 Lives 项目作为变异调用格式(VCF)获得，从Felis catus参考基因组 vs 9.0 中检索。该文件包括 84,005,772 个变体。

“通过基因型计数阈值激活变异”功能可通过 Golden Helix SVS 软件用于检测与疾病相关的变异。VCF 文件用作输入，所有样本都设置为“个体无关样本”，将两只受影响的阿比西尼亚猫设置为“真”，将所有其他猫设置为“假”以作为对照。

由于控制人群理论上包括疾病携带者，因此，阈值被设置为仅考虑存在于两只受影响猫中的变异，无论是杂合子还是纯合子基因型，以及存在于其余 195 只猫中的基因型频率 < 2%（包括纯合子）和（杂合子）。使用猫基因组组装的 vs 9，使用 Ensembl Variant Effect Predictor对产生的变体进行注释和研究其潜在功能。影响 miRNA 结合位点的错义、移码和 3'UTR 变体与蛋白质组和 miRNAome 数据整合。

从三只受影响的猫和三只健康的猫的每个块上切下两片10μm，将标本安装在载玻片上，并通过两次更换二甲苯，每次 10 分钟孵育来脱石蜡。将切片通过一系列分级乙醇（100%、95%、70%）各 5 分钟、蒸馏水再水化 5 分钟，然后在含有微型蛋白酶抑制剂混合物的 50 mM Tris HCl 缓冲液中孵育至少 30分钟。

用手术刀刀片收获水合组织切片，并在含有 8 M 尿素、20 mM Hepes pH 8 和微型蛋白酶抑制剂混合物的提取缓冲液中使用波特均质器进行均质化。将匀浆离心以沉淀未匀浆的组织和细胞碎片，其中含有蛋白质的上清液用 Bradford 的蛋白质测定进行量化。

提取的蛋白质经过还原、烷基化、和蛋白质消化通过使用序列级胰蛋白酶(Roche) 在37°C过夜。通过向样品溶液中添加2μL 98%甲酸来淬灭消化。使用反相Zip-Tip C18移液器吸头(Millipore)对蛋白水解消化物进行脱盐，并在65°C下在 SpeedVac 中蒸发。

针对Felis catus搜索MS光谱MaxQuant的参考NCBI序列数据库使用以下参数：单同位素前体离子的初始最大允许质量偏差为 15 ppm，MS/MS 峰为 0.5 Da，胰蛋白酶特异性，最大两个缺失的裂解，氨基******半胱氨酸作为固定修饰，N-末端乙酰化和甲硫氨酸氧化作为可变修饰。

通过针对相应的反向序列数据库搜索MS/MS谱图来估计错误蛋白质识别率 (1%)。所需的最小肽长度设置为 6 个氨基酸，支持蛋白质鉴定的最小独特肽数设置为 1。MaxQuant 中的定量是使用基于前体离子提取离子强度的无标记定量算法 (LFQ) 进行的。这种提取程序不区分纤维状和纤维相关的可溶性分子，并且这种类型的 MS 分析无法确定特定蛋白质的位置，因为其目的是表征受影响肾脏的蛋白质组。

将两只受影响的阿比西尼亚猫的变异与对照组的195只猫的变异进行比较，检测到 35,960 种潜在的疾病相关变异，其中大多数映射到基因间或内含子区域。第二常见的变异由“其他”变异类别代表，其中包括 5'UTR 变异、下游和上游基因变异、非编码转录本外显子变异和剪接区变异。35,960个变体包含27,105 个单核苷酸变体 (SNV)、5667 个缺失和 3188 个插入。

考虑到编码基因变异，确定了101个错义变异和一个移码缺失。此外，鉴于 3'UTR 区域中的SNV可以修饰miRNA结合位点，这可能会损害基因表达，因此检测到3'UTR 中的84个变体映射并选择用于其他分析。总体而言，考虑对 186 个变体进行额外分析，其中受影响的猫中有 23 个是纯合的，113 个是杂合的，一只受影响的猫有50个是纯合的，另一只是杂合的。

smallRNA-seq中每个样本的reads数量在27,607,431到52,126,090之间（平均值为40,267,032），除此之外，还有部分样本的reads数量在18-23 bp长度范围内最高，符合标准18 -22 bp 长度的成熟 miRNA 序列。样品 A1 和 A4 显示更多 10-17 bp 长度的读数，这可以解决非 miRNA 短 RNA 的存在。

在使用 TMM方法标准化之前和之后评估了文库大小、miRNA 密度和读取计数， miRDeep2 识别了总共 854 个不同的 miRNA 前序列，对应于 618 个独特的成熟序列，用相同的 miRNA 名称报告。在用 miRDeep2 过滤和归一化后，618 个 miRNA 成熟序列中只有 258 个被考虑。这些 miRNA 的总读数从7个读数 (hsa-miR-4529-3p) 到 29,052,681 个读数 (hsa-miR-10a-5p)，其中58个 miRNA 的读数少于 1,000，146 个 miRNA 的读数在 1,000 到 100,000 之间, 和 45 个 miRNAs 超过 100,000 reads (Supplementary Table 7)。

根据 miRDeep2，在 258 个 miRNA 中，有 71 个与人类 miRNA 不匹配，因此保留了软件分配的名称（前缀“NC”）。其余 187 个根据人类命名法命名（前缀“hsa-mir”）。这 71 个 NC_miRNA 前序列的手动 BLAST 显示了 8 个与人类的新匹配，这些匹配没有被 miRDeep2 识别，因此被添加到 187 个“hsa-mir”中，总共有 195 个人类 miRNA。

两个 miRNA 仅与牛和猪 miRNA 匹配，而 61 个 miRNA 仍然是“NC”，因此暂时被认为是猫科动物特异性 miRNA。这 71 个 NC_miRNA 前序列的手动 BLAST 显示了 8 个与人类的新匹配，这些匹配没有被 miRDeep2 识别，因此被添加到 187 个“hsa-mir”中，总共有 195 个人类 miRNA。

两个 miRNA 仅与牛和猪 miRNA 匹配，而 61 个 miRNA 仍然是“NC”，因此暂时被认为是猫科动物特异性 miRNA。这 71 个 NC_miRNA 前序列的手动 BLAST 显示了 8 个与人类的新匹配，这些匹配没有被 miRDeep2 识别，因此被添加到 187 个“hsa-mir”中，总共有 195 个人类 miRNA。两个 miRNA 仅与牛和猪 miRNA 匹配，而 61 个 miRNA 仍然是“NC”，因此暂时被认为是猫科动物特异性。

考虑到它们的相互作用，建议89种蛋白质受22种miRNA的调节。Hsa-miR-186-5p、hsa-miR-15a-5p 和 hsa-miR-24-3p的目标数量最多(n = 18)。网络中几乎所有的蛋白质都只在受影响的组织中表达89种蛋白质中只有 18 种只存在于健康对照中。对专门表征受影响肾脏的相互作用的更清晰概述排除了这 18 种蛋白质。

虽然大多数 miRNA 调节与受影响的猫和对照猫相关的蛋白质，但建议四种下调的 miRNA 仅与受影响组织中独占或上调的蛋白质相互作用。

根据 miRNet 数据库，显示了受影响标本中专门存在或上调的蛋白质与研究中鉴定的 miRNA 在病理肾组织中的相互作用。以红色圈出的 miRNA 代表仅有的四种 miRNA，它们专门调节与受影响的猫相关的蛋白质，而在对照组中没有发现。

在受影响的肾脏中发现的 miRNA 被用于基因目标预测研究，并且评估了 miRNA 目标信使和蛋白质的对应关系，从而更深入地了解该疾病的细胞机制。已经报道了所分析的 miRNA 的广泛表达范围，并且表明它与 miRNA 在特定组织或特定功能框架中的功能作用有关，这可能会影响它们的高表达或低表达。

四种显着下调的 miRNA 主要表征仅在病理组织中发生的相互作用。他们针对两种已知的“淀粉样变性”蛋白质（TTR 和 PABPN1）和溶解度因沉积物的存在而改变的蛋白质。Hsa-miR-144-3p 和 hsa-miR-590-3p 分别调节TTR和 Poly结合蛋白核( PABPN1 )的表达，据报道第一个参与 TTR 淀粉样变性沉积物，第二个一种存在于眼咽肌营养不良症的淀粉样蛋白样原纤维中。

Hsa-miR-26a-5p 调节六个基因，包括一个编码补体 C3的基因，据报道其上调促进了沉积物清除，以及一个编码热休克70 kDa 蛋白 (HSPA8) 的基因，它是其中之一在阿尔茨海默型淀粉样变性小鼠模型中，淀粉样蛋白在细胞外积累后，这些蛋白质被证明失去了溶解性。YWHAQ 也是 Xu 等人报道的蛋白质之一。并且它受 hsa-miR-151a-3p 的调节，hsa-miR-151a-3p 是第四个下调的 miRNA。

多组学数据整合强调了不同基因的存在，这些基因参与削弱和使肾脏易患不同综合征的发展，也为淀粉样变性及其副作用的发生创造了有利的背景。本研究的主要局限是样本数量少（由于它们的稀有性）、年龄差异（由于疾病的特征）、缺乏转录组分析（在FFPE上不可行）以及用于分析的工具一些数据分析。

总的来说，目前的数据表明阿比西尼亚猫淀粉样变性是多基因的，具有几种低外显率的遗传变异。这一发现与研究人员的想法一致，同时该研究发现了东方短毛猫疾病复杂遗传基础的证据。

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