牛病毒性黏膜病的症状及治疗：牛传染性鼻气管炎病毒应如何实现
文 | 十一情报局
编辑 | 十一情报局
牛传染性鼻气管炎病毒会引起牛传染性支气管炎和传染性阴道炎，在世界上很多国家流行，流行率为20%～90%，在我国的流行率为0%～88.9%。
疫苗接种可预防临床症状和减少排毒，能否成功预防取决于疫苗的质量和剂型，疫苗研发的第一步是选择合适的细胞系和培养条件，以提高疫苗的病毒含量。
IBRV可用胎牛、大鼠、猴、猪肾原代细胞培养，由于制备肾原代细胞需要大量的人力和物力，同时易受到外源病毒污染。
故原代细胞不适合用于疫苗制备和疫苗检验，一般选择传代细胞用于牛传染性鼻气管炎疫苗的研制。
由于不同的接毒量、不同的营养液、不同的接种时间、维持液中不同的血清含量都可能对收获的病毒液中的病毒含量产生影响，因此本试验开展了IBRV培养条件的优化研究。
●—≺开展试验≻—●
- 细胞和病毒
MDBK、PK15、Marc-145、Vero、BHK-21细胞，购自中国兽医药品监察所。
牛传染性鼻气管炎病毒（IBRVHL-2株），由西南民族大学馈赠。
- 培养基及试剂
DMEM培养基、MEM培养基，小牛血清，胰蛋白酶，PBS（0.01mol/L，自配），
- 方法
将MDBK、PK15、Marc-145、Vero、BHK-21传代T75细胞，待长至单层，弃营养液。
用18mLPBS洗一遍，加入200μL/瓶的IBRVHL-2株病毒液，36±1℃下作用1h，弃掉病毒液，加入含2%血清的MEM，36±1℃下培养。
同时各设对照细胞1瓶，逐日观察4d，若有病变，则在细胞病变达80%时冻存；若无细胞病变，则在96h冻存，连传3代。
将收获的病毒液分装成0.5～1mL/支，-70℃下冻存，将长至致密单层的MDBK细胞，按1∶4的比例传代，加入96孔细胞板，100μL/孔，培养24h左右，弃营养液。
将保存的病毒液用含2%血清的MEM进行10倍系列稀释，取10-1～10-7稀释度接种，8孔/稀释度，100μL/孔。
同时设正常对照细胞8孔，36±1℃和5%CO2下培养，连续观察7日，逐日观察细胞病变。
将长至致密单层的MDBK细胞，按1∶4的比例传代至T75细胞瓶，在36±1℃培养24h，取出1瓶，用胰酶分散，进行细胞计数。
根据细胞计数结果以及病毒含量结果，计算感染复数（moi），弃营养液。
用18mLPBS洗一遍，加入1.0、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001moi的IBRVHL-2病毒液，36±1℃下作用1h，弃掉病毒液，加入20mL含2%血清的MEM，36±1℃培养。
逐日观察，细胞病变达80%～85%时冻存，反复冻融3次，测病毒含量。
将长至致密单层的MDBK细胞，按1∶4的比例传代至T75细胞瓶，36±1℃培养16、20、24、28、32、36、40、44、48h，各取1瓶进行细胞计数。
在细胞传代后16、20、24、28、32、36、40、44、48h接种，接种后逐日观察。
细胞病变达80%～85%时冻存，反复冻融3次，测病毒含量。
细胞传代后24h，取3瓶弃营养液，加入含2%血清的MEM，加入0.01moi的病毒液；另取3瓶弃掉营养液，用18mLPBS洗一遍，加入0.01moi的病毒液，36±1℃下作用1h。
弃去病毒液，加入含2%血清的MEM，均在36±1℃下培养至细胞病变达80%～85%时冻存，反复冻融3次，测病毒含量。
细胞传代后24h，取3瓶弃掉营养液，加入含0%血清的MEM，加入0.01moi的病毒液。
另取3瓶弃营养液，加入含1%血清的MEM，加入0.01moi的病毒液，另取3瓶弃营养液，加入0.01moi的病毒液，加入含2%血清的MEM。
加入0.01moi的病毒液，另取3瓶弃营养液，用18mLPBS洗一遍，加入0.01moi的病毒液，加入含3%血清的MEM，加入0.01moi的病毒液。
均在36±1℃下培养至细胞病变达80%～85%时冻存，反复冻融3次，测病毒含量。
分别用血清含量为10%的DMEM和MEM传代培养相同代次的MDBK细胞。
细胞传代后24h，取用DMEM传代的细胞3瓶，弃掉营养液，加入含2%血清的DMEM，加入0.01moi的病毒液。
另取用MEM传代的细胞3瓶，弃掉营养液，加入含2%血清的MEM，加入0.01moi的病毒液。
均在36±1℃下培养至细胞病变达80%～85%时冻存，反复冻融3次，测病毒含量。
●—≺结果≻—●
- 不同细胞对IBRV（HL-2株）的敏感性
我们用MDBK、PK15、Marc-145、Vero、BHK-21五种细胞盲传3代，结果见表。
MDBK细胞对IBRVHL-2株敏感，能产生明显的细胞病变，对其他四种细胞不敏感，因此选择MDBK细胞用于IBRV培养。
- 不同接毒剂量对病毒增殖的影响
在传代后24h，细胞数量大约为（3.0±0.2）×106.0个/瓶，采用1.0、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001moi七种接毒剂量。
从下表可知，接毒量为0.01moi，达80%～85%细胞病变的时间在44±2h，收获的病毒液病毒含量为108.5±0.2TCID50/mL。
接毒量为0.05～1.0moi，达到80%～85%细胞病变的时间从38±2h缩短到20±2h，收获的病毒液病毒含量从108.0 ± 0.3TCID50/mL降低到107.0 ± 0.5TCID50/mL。
接毒量从0.005下降至0.001moi，达80%～85%细胞病变的时间从52±3h延长至68 ± 4h，收获的病毒液病毒含量从108.0 ± 0.5TCID50/mL降低到107.5 ± 0.5TCID 50/mL。
- 不同接种时间对病毒含量的影响
在传代后16～48h，随培养时间延长细胞数量不断增加，接毒量相同，接种后细胞病变达85%的时间随细胞数量增加而延长。
在细胞传代后24h，细胞数量达3.0 ± 0.2×106.0个/瓶，达85%细胞病变的时间在44 ± 2h，收获的病毒液病毒含量为108.5 ± 0.2TCID50/mL。
在细胞传代后28～48h，细胞数量从（3.5 ± 0.2×106.0个/瓶增加到（6.0 ± 0.2×106.0个/瓶，病变达85%的时间从46 ± 2h逐渐增加到68±4h，病毒含量从108.3 ± 0.2 TCID50/mL下降至107.0±0.5 TCID50/mL。
在细胞传代后16～24h，细胞数量从（2.0±0.2×106.0个/瓶增加到（3.0±0.2×106.0个/瓶，病毒含量从108.0 ± 0.3TCID50/mL增加至108.5 ± 0.2TCID50/mL。
- 不同接种方式对病毒含量的影响
采用两种接毒方式，一种是在弃培养基后，用PBS润洗一遍，加入病毒液，36±1℃下作用1h，弃病毒液，加入维持液（设为A）。
另一种是在弃培养基后，加入维持液，加入病毒液（设为B）。
两种方法接种相同剂量，细胞病变达80%～85%的时间均在44±2h，收获的病毒液病毒含量均在108.5±0.2TCID50/mL。
- 维持液中不同血清含量对病毒含量的影响
维持液中血清含量分别为0%、1%、2%和3%。
维持液中血清含量从0%增加2%时，细胞病变达80%～85%的时间从34±2h增加到44±2h，病毒含量从107.5±0.3TCID50/mL增加到108.5±0.2TCID50/mL。
血清含量从2%增加到3%时，病变时间从44±2h增加到48±2h，病毒含量从108.5±0.2TCID50/mL下降到108.3±0.2TCID50/mL。
●—≺分析与讨论≻—●
据报道，猴肾原代细胞、大鼠原代细胞、牛肾细胞、猪肾原代细胞可用于IBRV培养。
本文选择了MDBK、PK15、Marc-145、Vero、BHK-21五种细胞进行培养。
结果表明仅MDBK细胞对IBRVHL-2株敏感，这与MyroslavaHulyanych等报道的结果一致。
根据以往文献报道结果，IBRVBM株接毒量为0.01moi时收获的病毒含量最高，收获时间在40～48h，病毒含量在108.1±0.15TCID50/mL。
我们选择了1.0～0.001moi的接毒量进行试验，在接种0.01moi时收获的病毒含量为108.5±0.2TCID50/mL，收获时间在44±2h，与其结果基本一致。
但随着接种的病毒含量增加，达到收获的时间缩短，收获的病毒液病毒含量也下降。
其原因是接种量越大，感染的细胞越多，细胞越早凋亡，病毒复制减少，从0.01moi进一步下降到0.001moi。
随着接种量降低，收获时间延长，收获的病毒液病毒含量下降，其原因是病毒在37℃失去感染活力。
在细胞传代后16～24h，随接种时间延迟，收获的病毒含量增加。
在传代后24～48h，随接种时间延迟，收获的病毒液病毒含量降低，其原因是在传代后16～24h接种，细胞数量较少，接毒后细胞增殖数量较少，凋亡较早，导致收获时间提前，收获的病毒液病毒含量较低。
在传代后24～48h接种，细胞数量增加，接毒后细胞增殖数量增加较快，收获的时间延后，病毒在37℃失去感染活力，3.4关于不同接种方式对病毒含量的影响为了简化接种步骤，本研究采用两种接毒方式。
结果表明采用两种接毒方式收获的病毒液病毒含量相当，减少了接毒过程的操作步骤，降低了污染几率。
在维持液中添加血清，一是提高了生产成本，二是制备的疫苗中残留的血清可能引起动物应激反应，因此希望降低生产过程中的血清添加量。
本试验采用了维持液中血清含量为0%、1%、2%和3%进行研究，结果表明血清含量对收获的病毒液病毒含量存在影响，维持液中血清含量为2%时，收获的病毒液病毒含量最高。
这与MyroslavaHulyanych等报道的结果不一致，可能与所使用的MDBK细胞来源不同、培养基不同，细胞生长所需营养成分存在差异所致。
我们使用了MEM和DMEM两种培养基培养IBRVHL-2株。
结果表明用MEM培养基较用DMEM培养基收获的病毒液病毒含量更高，其原因可能是所使用的MDBK细胞来源不同，所需营养成分存在差异所致。
MDBK细胞对IBRVHL-2株敏感，能产生明显的细胞病变。
在细胞传代后24h接种，弃掉营养液，加入含2%血清的维持液，接入0.01moi的病毒液，接种后44±2h收获，所得的病毒液病毒含量最高。