辣椒炭疽病最佳治疗方案 用大自然的，兵器

<——引言——>

辣椒属茄科，是泰国重要的蔬菜之一，由于孢属真菌(Collectotrichum sp.)如辣椒炭疽病的发生，导致泰国和发达国家的辣椒作物产量降低。

放线菌是一种纤维状革兰阳性细菌，其中大多数成员的DNA序列G C含量高于55％。它们是医学酶和生物活性代谢产物生产的特别来源。

许多放线菌生物活性化合物，如抗生素，包括链霉素和四环素，尤其是属于链霉菌属的放线菌。

链霉菌属的微生物试剂已经被广泛认可多年，对于生产具有广泛抗菌和抗真菌活性的化合物至关重要。

迄今为止已经鉴定出近万种通过放线菌生产的抗生素。

80％的抗生素来自链霉菌属，不足的则来自微单孢属，不同来源获得的链霉菌可以在盆栽实验中有效减轻辣椒炭疽病。

从其他生物体内共生的链霉菌可能是寻找高效链霉菌属（Sterptomyces）的有趣来源。

该研究旨在筛选83株从白蚁肠道中分离的放线菌对引起辣椒炭疽病的植物病原真菌辣椒炭疽病菌（C. gloeosporioides）的抗性。

这些放线菌的培养液经过加热处理和未加热处理，以研究其抗真菌活性，此外，进行盆栽实验以评估所选放线菌菌株对辣椒炭疽病的有效性。

<——材料和方法——>

2011年9月至2012年11月期间在泰国帕纳空邦拉加巴特大学理工学院进行实验。

植物病原真菌的分离：研究从感染的辣椒中分离出了引起炭疽病的植物病原真菌辣椒炭疽病菌（C. gloeosporioides）。

分离出的真菌在室温下在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上培养，经过光学显微镜下形态学特征鉴定，确认为辣椒炭疽病菌，其菌落表现为白色到灰白色的菌丝，有大量鲜明橙色的分生孢子团成环状产生于菌落中心。

该分生孢子的形状为圆柱形，长约16微米，宽约5微米。

筛选放线菌的抗真菌活性：把248株放线菌在国际链霉菌计划（ISP）2号琼脂培养基上培养。

将放线菌培养物在PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）上单面条纹，间隔1.0厘米，然后在室温下孵育7天，将辣椒炭疽病菌（C. gloeosporioides chi）的活菌丝切割并转移到已培养的放线菌平板中央。

在培养7天后测量菌丝生长的抑制程度，抑制程度通过与对照菌株比较真菌菌落的半径来评估并进行三次重复培养。

培养物滤液测试：把有效的放线菌接种在ISP 2号培养基液体培养基中，在室温下震荡培养7天，转速为每分钟150转。

用无菌棉花过滤培养上清液，使用琼脂孔法测试在121℃加热处理和未加热处理的上清液对辣椒炭疽病真菌活性的影响。

将炭疽病菌（C. gloeosporioides chi）的活菌丝切割并转移至已培养的放线菌平板中央，在室温下孵育5天，将未加热和经过121℃加热处理的上清液各30微升滴入各孔，然后测量菌丝生长的抑制程度并进行三次重复培养。

通过十字划线法，在30±2℃下ISP 2号培养基和腐植酸维生素琼脂糖平板上培养14天后，观察菌落形态、颜色、孢子形成和可溶性色素等形态特征，确定所筛选出的放线菌属于哪个分类。

用聚合酶链反应（PCR）方法扩增放线菌的16S rDNA，用通用引物9F（5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1541R（5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'）进行制备。

聚合酶链反应产物经纯化后，使用Big Dye Terminator V3.1循环测序试剂盒（Applied Biosystems）和通用引物9F（5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、785F（5'-GGATTAGATACCCTGGTAGTC-3'）、802R（5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3'）和1541R（5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'）进行直接测序。

将核苷酸序列与其他细菌进行比较，使用Genetyx 5.0软件进行构建系统树（phylogenetic tree），并使用MEGA 4.0软件中的邻接法（neighbor-joining method）进行拓扑结构分析，基于1000次重复抽样进行统计学bootstrap方法进行分析。

接种物的制备：将100克米饭放入塑料袋中，在121°C下高压灭菌20分钟，然后接种S. malaysiensis R58或C. gloeosporioides chi，并在30℃下孵育1周，未接种的无菌米饭被用作盆栽实验中的对照。

温室接种：在种辣椒之前，将接种过的米饭颗粒通过混合添加5%的接种物散布在土壤中。

总共有四种处理组合：(T1)仅包含C. gloeosporioides chi而不含S. malaysiensis R58；(T2)同时包含S. malaysiensis R58和C. gloeosporioides chi；(T3)仅包含S. malaysiensis R58而不含C. gloeosporioides chi；(T4)对照组，不含C. gloeosporioides chi和S. malaysiensis R58。

通过观察抗炭疽病辣椒的生长和产量来监测放线菌的效果，每种处理组进行了12个辣椒盆栽实验。

数据分析：使用学生t检验确定放线菌的上清液和活菌对真菌的抑制显著性。

<——研究结果及其讨论——>

放线菌的抗真菌活性：采用双重培养技术在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）基质上测定了放线菌对球孢集束菌（C. gloeosporioides chi）的抗真菌活性。

通过对比处理组和未加处理组球孢集束菌（C. gloeosporioides chi）菌落的直径，评估了抑制百分比。

未加处理组的球孢集束菌（C. gloeosporioides chi）完全生长时，抑制率为0%，而不生长时，则为100%的抑制率。

结果表明，大多数来源于白蚁的放线菌具有广泛的抑制球孢集束菌（C. gloeosporioides chi）生长的能力。

在83个来源于白蚁的放线菌中，79个（95.2%）显示出21~100%的抑制率范围，下图显示了被测试放线菌对球孢集束菌（C. gloeosporioides chi）的抑制百分比。

有40个孤立菌株（48.2%）显示出高效率的抑制作用，显著抑制了球孢集束菌（C. gloeosporioides chi）的生长超过了60%。

此外，还有28（33.7%）和11个孤立菌株（13.2%）表现出在41~60%和21~40%范围内抑制球孢集束菌（C. gloeosporioides chi）的能力。

只有4个孤立菌株（4.8%）在低于20%的水平上对真菌病原的抑制作用不强，这表明，白蚁可能是孤立高效放线菌的适宜来源。

此外结果表明，从放线菌中获得的抗菌活性对辣椒炭疽病有效，可能的原因之一是放线菌的几丁质酶生产，然后分解真菌的细胞壁，另一个原因是，放线菌产生次生代谢物，如生物活性化合物，来抑制植物病原真菌的生长。

从素贴布皮国家公园和辣椒植物采集的土壤中孤立到的链霉菌属（Streptomyces sp.）对球孢集束菌（C. gloeosporioides）具有有效的活性。

大多数对球孢集束菌（C. gloeosporioides）和C. capsici具有活性的放线菌是链霉菌（87%），特别是卡维伦斯丝链霉菌（S. cavurensis），而长链多糖杆菌（Saccharopolyspora)、诺卡氏菌属(Norcardia)和诺卡二型菌(Nocadiopsis)则较少。

放线菌培养液的作用：上步中显示出高度对病原真菌敏感的40个孤立菌株进行培养和测试上清液的活性。

结果表明，从21个放线菌培养物中获得的上清液显着抑制了球孢集束菌（C. gloeosporioides chi）菌落。

这个积极的结果可能是由于放线菌产生的细胞外次生代谢物和抗真菌剂的存在，只有7个孤立菌株在121℃加热处理20分钟后产生的上清液显示出真菌菌落抑制作用。

结果表明，相比于加热处理的上清液，上清液具有更有效的真菌抑制作用，这是因为上清液中含有放线菌的活细胞，并能产生次生代谢物来对抗球孢集束菌（C. gloeosporioides chi）菌细胞。

其中孤立菌株R58对球孢集束菌（C. gloeosporioides chi）的抑制力最强，无论是加热处理的上清液还是未经加热处理的上清液。

与早期的研究结果一致，即发现所含有活放线菌细胞的培养滤液具有更好的抑制作用，而无菌滤液则没有。

形态学鉴定：孤立菌株R58接种在ISP培养基2号和腐殖酸维生素琼脂上进行形态学特征观察。

结果表明，孤立菌株R58为厌氧、革兰氏阳性、非酸酒精不耐性放线菌，形成广泛分枝的底物菌丝体。

该菌株产生带有纵向螺旋型孢链和浅黑色可溶性色素的棕色气生菌丝，并且气生孢子的颜色从白色到灰色不等，这个结果将菌株R58归属于链霉菌属。

分子鉴定：对R58菌株进行了16S rDNA序列生成，并比较了该序列与放线菌属成员的核苷酸序列，结果表明，该菌株属于链霉菌属。

其与马来西亚链霉菌的亲缘关系得到两种树形算法和高bootstrap值的支持。

菌株R58对辣椒炭疽病的应用：将马来西亚链霉菌R58和辣椒炭疽病菌C. gloeosporioides chi培养物施于生长了3个月的辣椒盆栽上，除负对照组外。

一周后检查C. gloeosporioides chi和S. malaysiensis R58对辣椒盆栽的效果，结果表明接种C. gloeosporioides chi的处理1(T1)在辣椒植株和果实上表现出高水平的辣椒炭疽病症状。

在T1中加入S. malaysiensis R58后，辣椒植株和果实的炭疽病显著减轻。

此外，加入S. malaysiensis R58到辣椒盆栽中对辣椒植株没有负面影响，如T3所示。

T3和T4中未加入C. gloeosporioides chi，所以辣椒植株和果实没有显示出炭疽病的症状，这表明S. malaysiensis R58可以作为生物制剂用于控制炭疽病。

抗生素被认为是提供生物防治的一种方式，因为微生物可以迅速产生抗生素并解触致病真菌。

Prapagdee等人使用水浸链霉菌对兰花的炭疽病进行生物防治，以抑制C. gloeosporioides的生长，Streptomyces sp. SRM1还用于香蕉炭疽病的生物防治。

多项研究证明，许多由链霉菌菌株产生的次生代谢产物能够对植物真菌病原体发挥作用。

有许多报告表明，链霉菌可以产生几丁质酶和葡聚糖酶酶来溶解致病真菌的菌丝。

<——结论——>

放线菌作为一种具有抗病、调节植株生长和促进产量的生物防治剂，对辣椒的生产具有重要的意义。

通过深入研究放线菌的菌株筛选和生物发酵过程，未来可以进一步提高其生物防控的效果，帮助农民们更好地控制辣椒炭疽病，提高辣椒的产量和质量。

参考文献

1. "Effects of irrigation and NPK fertilizer on production, water use efficiency and quality of hot pepper (Capsicum annuum L.) in semi-arid region of West Africa" published in the journal Agricultural Water Management in 2018.

2. "Optimization of Nutrient Management for Yield and Quality of Hot Pepper (Capsicum annuum L.) Using Response Surface Methodology" published in the journal Horticulturae in 2019.

3. "Effect of Improved Soil Fertility Management Practices on Growth, Yield and Quality of Chilli Pepper (Capsicum annuum L.) Grown under Humid Tropical Conditions" published in the journal International Journal of Agriculture and Biology in 2016.

4. "Crop management practices to enhance productivity and profitability of hot pepper (Capsicum annuum L.) in Ethiopia: A review" published in the journal Heliyon in 2021.

5. "Improving yield and quality of chili pepper (Capsicum annuum L.) by application of organic manure and inorganic fertilizer under rain-fed condition" published in the journal International Soil and Water Conservation Research in 2021.