大鲵是胎生的还是卵生的动物：对体内-锌螯合物及其结构表征进行研究

前言

大鲵又名娃娃鱼，1988年被列入《中华人民共和国野生动物保护法》中，属于国家二级重点保护两栖野生动物，是农业产业化和特色农业重点开发品种。大鲵在长江、黄河及珠江流域等地区均有分布。我国法律规定只有人工饲养的子二代大鲵可用来食用及买卖等商业用途。大鲵是一种食用价值极高的动物，含有优质蛋白质，丰富的氨基酸和微量元素，其营养丰富，是滋补保健珍品，被誉为“水中人参”。

同时大鲵还是一种传统名贵药用动物，在《本草纲目》、《本草经集注》等药典中有“治痴疾、治牛、治斑疾”的记载，表明大鲵入药后具有益智、美容、益肤等功能。研究发现大鲵肌肉中含有70多种天然生物活性物质，可改善生理代谢、促进蛋白质合成、延缓衰老、提高机体免疫力和造血功能，对防止恶性贫血、心脑血管疾病等方面有很好的作用。在功能性食品、化妆品和医药等方面显示出了潜在的应用价值。

1.实验材料与试剂

人工养殖子二代大鲵肽粉（威海市某生物工程有限公司），抗坏血酸（天津市某科技发展有限公司），其他试剂均为国产分析纯。

2.实验仪器与设备

电热恒温鼓风烘箱（XMT）；电热恒温水浴锅（HH-4）；低温冷冻离心机（GL-21M）；精密pH计（PHS-3C）；双光束分光光度计（HITACHIU-2900）；傅里叶变换红外光谱仪（370DTGS）；扫描电子显微镜（SS-60）。

1.大鲵肽-锌螯合物的制备

称取一定质量的大鲵肽粉和硫酸锌，分别使用少量蒸馏水溶解后定容，配制一定浓度的大鲵肽和硫酸锌溶液。按一定体积比加入两种溶液并混合均匀，用0.1mol/LNaOH或HCl溶液调至所需pH，置于一定温度下反应至所需时间。冷却后，加入一定体积的无水乙醇，在7500r/min的离心条件下离心15min，去除上清液，用适量的95%的乙醇洗涤离心1~2次。将沉淀物置于50℃的电热鼓风干燥箱中烘干，得大鲵肽-锌螯合物，每组设3个平行组，计算螯合物中锌的螯合率及螯合物的得率。

2.锌的螯合率及螯合物得率的测定

首先测定大鲵肽-锌螯合物中锌的质量，根据《GB25579-2010食品安全国家标准食品添加剂硫酸锌》中锌含量测定方法并进行改进。称取0.06g大鲵肽-锌螯合物，置于100mL锥形瓶中，加少量水润湿，滴加2滴50%（v/v）硫酸溶液使试样溶解，加10mL去离子水、2mL氟化氨溶液（200g/L）、0.5mL硫脲溶液（200g/L）和0.04g抗坏血酸，摇匀溶解后加入3mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH=5.5）和2滴二甲酚橙指示剂（2g/L），用0.05mol/L乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液滴定由紫红色变为亮黄色为终点，同时做空白实验。

试样中锌质量X（g）按下式计算：X=（V1-V2）×C×0.001×65.39式中：V1—滴定试样溶液所消耗的乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液体积，mL；V2—滴定空白溶液所消耗的乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液体积，mL；C—乙二胺四乙酸二钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；65.39—锌的相对分子质量。锌的螯合率及螯合物得率按照以下公式计算：锌的螯合率（%）=W2/W1×100式中：W1—反应体系中锌的总质量，g；W2—螯合物中锌的总质量，g。螯合物得率（%）=W4/W3×100式中：W3—初始反应物的总质量，g；W4—反应后大鲵肽锌螯合物的总质量，g。

1.大鲵肽与硫酸锌质量比的筛选

称取一定质量的大鲵肽粉末，加水溶解，按照肽锌质量比5:1，10:1，15:1，20:1，25:1，30:1，35:1，40:1分别加入硫酸锌溶液，定容至40mL，肽浓度0.025g/mL，pH5.18，温度60℃，反应时间60min，沉淀剂为反应液体积的5倍，测定大鲵肽-锌质量比对螯合率的影响。

2.螯合pH的筛选

称取一定质量大鲵肽粉末，加水溶解，按照肽锌质量比25：1加入硫酸锌溶液，定容至40mL，肽浓度0.025g/mL，调节pH分别为4，5，5.18（自然pH），6，7，8，9，温度60℃，反应时间60min，沉淀剂为反应液体积的5倍，测定pH对螯合率的影响。

3.螯合时间的筛选

称取一定量大鲵肽粉末，加水溶解，按照肽锌质量比25:1加入硫酸锌溶液，定容至40mL，肽浓度0.025g/mL，pH5.18，温度60℃，分别螯合反应10，20，30，60，90，120，150min，沉淀剂为反应液体积的5倍，测定时间对螯合率的影响。

4.螯合温度的筛选

称取一定量大鲵肽粉末，加水溶解，按照肽锌质量比25:1加入硫酸锌溶液，定容至40mL，肽浓度0.025g/mL，pH5.18，在温度40，50，60，70，80，90℃下，反应时间60min，沉淀剂为反应液体积的5倍，测定温度对螯合率的影响。

5.肽质量浓度的筛选

称取一定量大鲵肽粉末，加水溶解，按照肽-锌质量比25:1加入硫酸锌溶液，定容至40mL，在肽浓度分别为0.02，0.04，0.06，0.08，0.1g/mL，pH5.18，温度60℃，反应时间60min，沉淀剂为反应液体积的5倍，测定大鲵肽浓度对螯合率的影响。

6.沉淀剂乙醇用量的筛选

称取一定量大鲵肽粉末，加水溶解，按照肽-锌质量比25:1加入硫酸锌溶液，定容至40mL，肽浓度0.04g/mL，pH5.18，温度60℃，反应时间60min，沉淀剂为反应液体积的1，2，3，4，5，6倍，测定沉淀剂乙醇对螯合率的影响。

1.傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析

大鲵肽与大鲵肽-锌螯合物的红外光谱测定采用KBr压片法。取2mg的固体样品粉末与200mg光谱纯级KBr混合并研磨，压制成透明薄片，在4000～400cm-1波段内对样品进行扫描，分辨率0.1cm-1，分析其特征峰。

2.紫外扫描分析

配制溶液浓度为0.1mg/mL的大鲵肽溶液和大鲵肽-锌溶液，以去离子水完成空白校准，用紫外分光光度计在190nm~400nm波长范围内扫描观察紫外吸收变化情况。

3.扫描电镜分析

通过扫描电子显微镜研究大鲵肽和大鲵肽-锌螯合物的形态结构，扫描条件如下：高压5kV，工作距离13.4mm，放大倍数范围为1-60k倍。

结果与分析

4.大鲵肽与硫酸锌质量比的筛选试验

在大鲵肽与硫酸锌质量比为5:1至40:1范围内，锌的螯合率随着质量比的增大而增大，在25:1时，螯合率达到81.94%，当比值继续增大时，螯合率呈缓慢上升趋势。螯合物得率随质量比的增大呈下降趋势。由上述结果可知，当肽锌质量比过低时，锌的螯合率较低，造成锌源的浪费；当肽锌质量比过高时，螯合物的得率较低，大鲵肽的有效利用率降低，造成原料的浪费。因此，肽锌质量比为25:1左右时比较合适，选择此比值作为后续试验条件。

5.pH的筛选试验

在肽质量分数为0.025g/mL，大鲵肽硫酸锌质量比为25:1时，不经pH调节，反应液pH为5.18，此时螯合率为83.06%；得率为58.63%。当pH过低时，氢离子会取代金属离子，影响螯合物的形成。随着pH的增大，氢氧根离子逐渐增多，导致生成氢氧化锌沉淀，不利于螯合物的制备，螯合率下降，这与富天昕和王晴等人的结果一致。综上以自然pH为后续实验条件。

6.反应时间的筛选试验

螯合率随着时间的延长呈现基本稳定的趋势（P>0.05），当螯合时间为60min时达到最大值，延长反应时间，其螯合物得率基本稳定（P>0.05），螯合率下降的主要原因是由于螯合环状结构不稳定，导致部分配合物解离。综上选取60min为后续试验条件。

7.反应温度的筛选试验

温度对螯合率有显著的影响，随着温度的升高，螯合率呈现缓慢上升趋势，当反应温度为60℃时，螯合率达到峰值且趋于稳定。温度对螯合物得率影响较小，综上选取60℃为后续实验条件。

8.肽质量浓度的筛选试验

当肽浓度为0.04g/mL时，螯合率达到最大值，螯合物得率呈现缓慢上升趋势。这是由于多肽浓度增大时，多肽活性反应基团与锌离子的碰撞概率增加，促进了螯合物的形成。因此选取0.04g/mL为后续实验条件。

9.沉淀剂乙醇用量的筛选试验

沉淀剂乙醇用量对螯合反应的影响很大，随着乙醇用量的增加，螯合物的螯合率及得率随之增加，在乙醇用量为反应液体积的4，5，6倍时，螯合率分别为79.45%，88.25%，87.43%，得率分别为56.08%，57.88%，58.04%。因此选择乙醇用量为反应液体积的4，5，6倍作为响应面实验条件。

大鲵肽和大鲵肽-锌螯合物的傅里叶光谱所示，灰色显示的是大鲵肽的红外光谱图，黑色点状线条显示的是大鲵肽-锌螯合物的红外光谱图。大鲵肽与有机配体锌离子的相互作用表现为肽链中羧基和酰胺基吸收带的改变，大鲵肽的—NH2的吸收峰为3269cm-1，酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅱ带的Ｃ=Ｏ的特征峰为1627cm-1和1513cm-1，—COO-的吸收峰为1387cm-1，与硫酸锌反应后—NH2的吸收峰为3357cm-1，酰胺Ⅰ带和Ⅱ带Ｃ=Ｏ的特征峰为1611cm-1和1493cm-1，—COO-的吸收峰为1351cm-1。

与大鲵肽的红外光谱图相比，当大鲵肽和有机锌离子螯合后，整个谱图的波形发生了改变，在617cm-1处和519cm-1处的两个吸收峰合并成为一个波数在595cm-1的吸收峰，可能是因为C—H面外弯曲振动引起的。其特征吸收峰的显著位移表明大鲵肽与锌离子反应所形成的螯合物，是一种不同于母体分子的新化合物，肽键上的氨基、羧基、羰基都参与了螯合反应，与锌离子发生结合后生成了新的物质。

紫外扫描分析

大鲵肽和大鲵肽-锌螯合物的紫外吸收光谱有显著的差异。大鲵肽的强吸收峰在200nm左右，280nm左右无特征吸收峰，这与肽键的光谱特征和肽中不含色氨酸有关。加入锌离子后大鲵肽的最大吸收光从200nm偏移到210nm附近，大鲵肽-锌螯合物的吸光值明显低于大鲵肽的吸光值，随着锌离子的加入，大鲵肽的特征峰发生了蓝移和下降，这是由于锌离子与多肽羰基上的氧原子和氨基键上的氮原子结合所致。吸收峰的偏移和峰强度的变化表明了大鲵肽与锌离子发生了螯合生成了一种新的物质大鲵肽-锌螯合物。

扫描电镜分析

利用扫描电镜对大鲵肽粉末和大鲵肽-锌螯合物粉末的微观表面结构进行观察，大鲵肽和大鲵肽-锌螯合物的扫描电镜。大鲵肽与大鲵肽-锌螯合物表面结构有明显的差异。大鲵肽呈现出光滑的规则球体颗粒形状和片状；大鲵肽与锌螯合后则呈现出不规则形状且多为聚合状态，具有点状和褶皱形态，具有更大的比表面积和孔隙率。

Xiao等人研究表明锌结合后增加了肽的粗糙度，这是由于锌离子与肽的氨基酸残基在脱水过程中相互作用加速了肽的二聚，并产生了二聚体。由于分子间作用、表面张力等作用，肽变成颗粒聚集形成了更大的吸收蔟，此外，水溶液中分子间的氢键也导致肽中的羰基、羧基和氨基的折叠和聚集。

1. 本文通过对大鲵肽-锌螯合物的制备工艺进行了单因素和响应面试验确定了最佳螯合工艺：大鲵肽与硫酸锌质量比为25：1、螯合pH为5.18、醇沉倍数5、肽浓度0.04g/mL、螯合温度60℃、螯合时间60min。大鲵肽-锌螯合物的螯合率与螯合得率分别为88.57%、57.25%。（2）通过对傅里叶红外光谱图分析可知大鲵肽与锌离子反应后形成了一种不同于母体分子的新化合物，肽键上的氨基、羧基、羰基都参与了螯合反应，与锌离子发生结合后生成了新的物质。

紫外光谱图中发现，大鲵肽-锌螯合物的特征峰发生了蓝移和下降，吸收峰的偏移和峰强度的变化表明了大鲵肽与锌离子发生了螯合生成了一种新的物质。（3）通过扫描电镜发现大鲵肽为光滑的规则球体颗粒形状和片状；大鲵肽-锌螯合物为不规则形状且多为聚合状态。