western-blot的原理及应用：生物科研狗必备技能之
这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列
的特异性试剂作为探针检测之。Western 使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋
白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混
合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。
仪器： 高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转
移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。
试剂： 单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250 考马斯
亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS 上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、
10X 丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、发光液。
杂品与耗材： 各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃材；
硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（>20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短
各一根，计时器，吸水纸。
western blot 主要试剂的配方：
1. 5×电泳缓冲液配方(1L)
Tris-Base 15.1 g
甘氨酸（Glycine） 94g
SDS 5 g
注意事项：
a.加水时应尽量避免气泡的产生，否则会造成过多SDS的损耗。
b.配制好的溶液放于4度冰箱保存，使用时用纯水稀释至1×使用。
2. 1×转膜液配方（1L）
甘氨酸(Glycine) 2.9 g
Tris-Base 5.8 g
SDS 0.37 g
甲醇 200 mL
注意事项：
a.加入适量的纯水，用磁力转子将各组分溶解后加入甲醇溶液，最后用纯水定容至1L（甲醇气
味大，通风厨内配制，并注意戴口罩）。
b.加水时应尽量避免气泡的产生，否则会造成过多SDS的损耗。
3. 10×TBS配方（1L）
Tris-Base 24.2 g
NaCl 80 g
注意事项：
a.加入适量的纯水溶解各组分后，使用浓盐酸或浓氢氧化钠溶液调节溶液的PH至7.6（一般溶
解后溶液是偏碱的，所以选用浓盐酸调节PH至7.6即可）。
b.使用PH计调节溶液的PH前，要按照说明书校准PH计。
c.PH调节至7.6后，用纯水定容至1L，使用时稀释10倍至1×使用。
d.配制TBST时，在1×TBS中按照1:1000的比例加入吐温20充分混匀即可。
4. 30%丙烯酰胺单体储存液配方（100ml）
丙烯酰胺（Acrylamide） 29 g
N,N`-亚甲双丙烯酰胺（N,N`-Methylene Bisacrylamide) 1g
注意事项：
a. 将各组分溶于总体积为60ml的纯水中，加热至37℃完全溶解，用纯水定容至100ml。
b. 用装0.45µm膜的滤器过滤，置于棕色瓶中保存于4℃冰箱保存。
c. 丙烯酰胺有神经毒性，操作时戴手套，并注意不要造成实验台面等的污染。
5. 上液（1M Tris-HCl PH=6.8）配方（50ml）
Tris-Base 6.057 g
三蒸水 40 mL
注意事项：用浓盐酸调节PH至6.8，再用三蒸水定容至50ml，4℃冰箱保存。
6. 下液（1M Tris-HCl, pH8.8 ）（50ml）
Tris-Base 9.08 g
三蒸水 40 mL
注意事项：用浓盐酸调节PH至8.8，再用三蒸水定容至50ml，4℃冰箱保存。
Western Blot 主要流程：
1. 蛋白样品的提取
1.1 常用裂解液及其特点
1.2 蛋白质提取方法
（1） RIPA强裂解法：
a. 取适量胰酶消化细胞（针对对贴壁细胞，悬浮细胞可省略此步），收取细胞，PBS洗两遍，
600g离心5min，尽量去除PBS，向细胞沉淀中加入适量的预加了蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA
强裂解液（80ul——200ul不等，根据自己细胞量的多少定）。
b. 冰上裂解40min，每5min剧烈涡旋一次。
c. 充分裂解后，14000rpm，4℃离心15min，将上清转至另一预冷的EP管中（不要吸到管底的沉淀）。
注意事项：
a. 整个过程尽量在冰上操作，因为蛋白在常温降解速度很快，而在冰上则能显著的减慢这一过程。
b. PMSF有毒，注意戴手套，并注意不要造成实验台面等的污染。
（2）SDS煮沸法（此方法对Caspase家族切割条带具有特效）
a. 收取细胞，PBS洗两遍，600g离心5min，尽量去除PBS。
b. 向细胞沉淀中加入适量的预加了蛋白酶抑制剂PMSF的SDS裂解液（80ul—200ul不等，根
据自己细胞量的多少定）。
c. 将EP管放在加热器上95-100℃加热20min以上，加热至样品中的核酸粘稠物(细胞内核酸)完全溶解为止。
d. 充分裂解后，14000rpm，4℃离心15min，将上清转至另一预冷的EP管中（不要吸到管底的沉淀）。
注意事项：
a. 由于加热的温度很高为95℃，煮沸的全过程中，不要离开蛋白样品，防止EP管炸开而损失
蛋白样品，甚至蛋白样品被蒸干。具体技巧与方法：放物体压住EP管，待加热时间快结束时，
停止加热，冷却到一定时间，轻轻拿开物体，轻轻拿出EP管。
b. 尽快将核酸粘稠物煮化，缩短提取蛋白时间。具体技巧与方法：加热前适度涡旋，加热过程中用剪去尖端的枪头吹打样品。
c. 提取的蛋白样品置于-20℃保存。
（3）细胞刮法（针对贴壁细胞）
a. 倒掉培养基，PBS洗培养皿2次。
b. 吸尽残留的PBS，加入预加了PMSF的SDS裂解液50-500Ul,迅速用细胞刮将细胞刮下，并将
裂解后的细胞转移到EP管中，其他步骤同SDS煮沸法。
注意事项：整个过程尽量在冰上操作以减慢蛋白的降解。
2. 蛋白样品的定量
本实验室采用BCA法测定蛋白质浓度，具体步骤：
a. 将各蛋白样品稀释20倍（根据自己蛋白样品的浓度可加大稀释倍数）至总体积为40ul或以
上，以供每个样品3个复孔。
b. 将蛋白样品和蛋白标准品加入96孔板中，每孔10ul，每个样品3个复孔。
c. 配制显色液，充分混匀，加入96孔板，每孔100ul。
d. 37℃孵育30min，酶标仪检测吸光度。
注意事项：
a. 尽量将样品加在96孔板的中间位置，避免酶标仪检测时的边缘效应。
b. 加入样品和显色液的过程中尽量避免气泡的产生。
c. 选用精确度高的移液枪，尽量使用进口的枪头。
3. SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制
3.1 不同浓度胶的最佳分离范围
SDS-PAGE分离胶浓度 最佳分离范围
6%胶 50-150kD
8%胶 30-90kD
10%胶 20-80kD
12%胶 12-60kD
15%胶 10-40kD
3.2 不同浓度胶的配制
成分 配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积(毫升)
6%胶 5ml 10ml 15ml 20ml 30ml 50ml
蒸馏水 2.0 4.0 6.0 8.0 12.0 20.0
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