酵母双杂交实验是体内还是体外 实验技能丨酵母双杂交实验超详细protocol

实验原理

酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。

实验步骤

酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为:

1、构建重组Activation Domain（AD）融合的重组质粒（pGADT7载体）以及Binding Domain（BD）融合的重组质粒（pGBKT7载体）；

2、双向酵母双杂交实验鉴定蛋白质间的相互作用

2.1 酵母转化中DNA 混合液的配制

在制备酵母感受态的过程中配制下面的DNA 转化混合液（1×）：

2.2 酵母感受态细胞的制备以及共转化

下面是所需用量为10 个转化实验的酵母感受态细胞的制备。

（1） 挑取平板上AH109 酵母细胞的单个克隆至5 ml YPD 培养基中，30℃

摇床振摇培养过夜（可加入2 mg/ml 的Adenine 75 μl 使酵母生长速度加快）；

（2） 转接2.5 ml 过夜培养的菌液至50 ml YPD 培养基中继续培养约3-4 h（OD600~2-4）；

（3） 用50 ml 的离心管收菌，4,500 rpm，3 min；弃上清；

（4） 加入20 ml 无菌水洗涤，同样条件离心；弃上清；

（5） 用1 ml 无菌水重悬菌液，转移至1.5 ml 的EP 管中；

（6） 最高速短时离心15 sec；弃上清；

（7） 加入450 μl LiAc (0.1 M) 重悬菌体，30℃摇床振摇培养15 min；

（8） 分装50 μl/管至EP 管中；

（9） 最高速短时离心15 sec；弃上清；

（10） 每管加入已经配制好的DNA 转化混合液（可加入40 μl DMSO 以提高转化效 率），彻底重悬细胞，30℃摇床振摇培养45 min；

（11） 转移至42℃水浴20 min；

（12） 冰上放置3 min；

（13） 最高速短时离心30 sec；弃上清；

（14） 加入100 μl 无菌水重悬菌体，涂布于SCM/-2(缺少色氨酸和亮氨酸的酵母合成培养基)氨基酸缺陷型平板上。30℃恒温箱倒置培养3 天后观察菌落生长情况。

2.3 酵母双杂系统相互作用的筛选

（1） 3 天后，在转化后的平板上各挑取四个单菌落，分别划线于SCM/-2、

SCM/-3 (缺少色氨酸、亮氨酸和组氨酸的酵母合成培养基) 和SCM/-4 (缺少色氨酸、亮氨酸、组氨酸和腺嘌呤的酵母合成培养基)氨基酸缺陷型平板上，30℃恒温箱倒置培养3 天后观察菌落生长情况。

（2） 如果菌落能在SCM/-4 平板上正常生长，说明AD-fusion 和BD-fusion两者之间有强的相互作用；如果不能在SCM-4 平板上正常生长但是能在SCM/-3平板上正常生长，则有弱的相互作用；如果在SCM/-4 和SCM/-3 平板上均不能生长而只能在SCM/-2 平板上生长，则无相互作用。

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